Substrat-Translokation im 20S-Proteasom aus Thermoplasma acidophilum

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Das 20S Proteasom ist ein multikatalytischer Proteasekomplex von etwa 700 kDa, der in allen drei Lebensreichen vorkommt. In Eukaryonten bildet es zusammen mit den 19S Kappenkomplexen das 26S Proteasom, welches Teil des ATP-abhängigen Ubiquitin-Proteasom-Systems ist. Der Eingang des 20S Proteasoms hat eine Pore mit einem Durchmesser von 1,3 nm, deren Durchlässigkeit als geschwindigkeitsbestimmender Schritt der Substrattranslokation gilt. Der Mechanismus der Porenöffnung ist bekannt, jedoch ist die Substratverteilung im Inneren des 20S Proteasoms wenig erforscht. Um mehr Einblick zu gewinnen, wurden fluoreszenz-markierte Host-Guest-Komplexe sowie α-Synuclein-20S Proteasom Hybridproteine für NMR-Untersuchungen hergestellt. Die dynamische Verschiebung der α-Unterheiten bei Bindung des regulatorischen Komplexes ist ebenfalls unklar. Eine umfangreiche Mutationsanalyse wurde durchgeführt, um den Einfluss der strukturellen Flexibilität auf den Substratumsatz zu untersuchen. Punktmutationen an α-α und α-β Kontaktflächen wurden eingeführt, was zu einem signifikant höheren Casein-Umsatz bei bestimmten Mutationen führte. Dies könnte auf eine zusätzliche Aktivierung des 20S Proteasoms durch Unterbrechung von Wasserstoffbrücken hinweisen. Zudem wurden Cysteinmutationen zur Bildung von Disulfidbrücken eingesetzt, um die Flexibilität zu verringern. Obwohl die angestrebte Versteifung nicht nachgewiesen werden konnte, wurde entdeckt, dass besti