Entwicklung eines Expressionsscreenings zur Herstellung antimikrobieller Peptide

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Die zunehmende Ausbreitung antibiotikaresistenter Erreger erfordert die Entwicklung neuer Wirkstoffklassen oder alternativer Strategien. Antimikrobielle Peptide (AMPs) aus Insekten stellen vielversprechende Kandidaten dar, da sie eine große Diversität aufweisen und unterschiedliche Wirkspektren gegen viele Mikroben besitzen. Um diese AMPs für Forschung und Medizin nutzbar zu machen, ist eine rekombinante Herstellung in großen Mengen notwendig. Allerdings sind viele AMPs toxisch für potenzielle Expressionswirte oder enthalten Disulfidbrücken, was die Expression erschwert. Daher muss die optimale Kombination aus Expressionsstamm und -plasmid (einschließlich Promotor und Fusionspartner) für jedes AMP empirisch ermittelt werden. In dieser Arbeit wurde ein Expressionsscreening in E. coli entwickelt, um systematisch nach den Parametern zu suchen, die eine maximale lösliche Proteinausbeute ermöglichen. Hierbei wurden die Elemente des Expressionsplasmids, wie Promotor und Fusionspartner, sowie der Bakterienstamm variiert. Eine kombinatorische Plasmidbibliothek wurde mithilfe der Golden Gate-Klonierung erstellt, die eine freie Kombination von Plasmidelementen ermöglicht. Die Effizienz der Klonierung und das Expressionsscreening wurden für drei Modell-AMPs mit unterschiedlichen Eigenschaften untersucht. Für AMPs, die sich nicht in E. coli exprimieren lassen, wurde ein Protokoll zur Herstellung stabil exprimierender, monoklonaler Schneid